【NIR-II近红外二区成像】近红外二区小动物活体成像-金属石墨纳米囊研究进展

摘要 多功能金属石墨纳米囊由于其良好的稳定性和独特的理化性质, 在生物医学领域受到了广泛关注. 利用石墨烯外壳独特的拉曼散射特征峰作为拉曼标签或者内标, 结合等离子体纳米核优异的表面增强拉曼散射(SERS)和双光子发光(TPL)性能, 可实现SERS生物分析以及肿瘤细胞或组织的Raman/TPL双模成像. 利用表面积大的石墨烯外壳作为药物负载平台, 结合等离子体纳米核的近红外光吸收能力, 可实现光介导的病原菌杀灭以及肿瘤细胞或实体瘤的热疗与化疗的协同治疗. 此外, 利用石墨烯外壳优异的荧光猝灭性能, 还实现了生物分子的荧光检测; 利用磁性纳米核独特的磁学性能, 可实现生物样品的分离和富集、细菌的原位磁共振成像检测以及磁靶向胃部口服药物的递送. 本综述首先介绍了金属石墨纳米囊的制备、分类和性质, 然后概述了它们在生物检测、生物成像和治疗3个方面的应用进展, 并进一步总结了它们的发展现状包括生物毒性和生物医学应用的优缺点, 最后对其在生物医学领域的发展方向做出了展望. 我们期望多功能的金属石墨纳米囊能够为今后的临床生物医学应用提供可靠的纳米平台.

关键词 金属石墨纳米囊；生物检测；生物成像；治疗

富勒烯、碳纳米管和石墨烯等石墨纳米材料因其独特的理化性质，引起了广泛的研究兴趣［1~3］. 近年来，基于碳量子点的生物传感和成像系统［4，5］、基于氧化石墨烯的生物传感和药物递送系统［6，7］以及碳纳米管的治疗应用研究［8，9］等相继被报道，为石墨纳米材料在生化分析和生物医学领域的发展奠定了基础. 石墨纳米材料具有大的比表面积、优异的荧光猝灭性能、易于功能化、良好的生物相容性及拉曼散射截面远大于常规的有机拉曼报告分子等优势［10~12］. 为了扩大其应用范围，很多研究工作集中在石墨纳米材料与其它金属纳米材料的联合应用上［13~16］. 然而，大多数报道的金属/石墨杂化纳米材料在苛刻的条件（如长时间的激光照射、高浓度盐溶液或者强酸性胃部环境）下难以保持完整的形貌和稳定的性能，可能会导致分析结果不准确，甚至带来意想不到的生物毒副作用.

金属石墨纳米囊是一种将金属纳米核限域在少层石墨烯壳层内部的新型石墨纳米材料，展现出优异的稳定性和良好的生物相容性，在生物医学领域备受关注［10，11］. 金属石墨纳米囊兼具有石墨纳米材料和金属纳米材料的双重优良特性，利用石墨烯外壳的优点，并通过可控设计和制备金属核种类、尺寸和形貌各异的金属石墨纳米囊，可为不同的生物医学应用提供良好的纳米平台［10，11，17］. 利用石墨烯外壳独特的拉曼散射特征峰作为内标，特别是位于细胞静默区（1800~2800 cm−1范围内的拉曼光谱区间）的2D（~2650 cm−1）峰能够避免来自环境和生物分子的干扰，并且石墨烯外壳避免了内部金属核与待测物或者外界环境的直接接触，既不会引起待测物分子的光碳化也不会引发不必要的反应，提高了表面增强拉曼散射（SERS）生物分析的准确性［18~20］. 利用石墨烯外壳的拉曼散射特征峰作为拉曼标签，结合等离子体纳米核优异的SERS和双光子发光（TPL）性能，实现了肿瘤细胞或组织的拉曼成像以及拉曼和TPL双模成像［21~23］. 利用具有大比表面积和离域π 电子结构的石墨烯外壳作为化疗药物的负载平台，结合等离子体纳米核的近红外光吸收能力，可实现病原菌光热治疗以及癌细胞和实体瘤的热疗与化疗的协同治疗［23~25］. 此外，利用石墨烯外壳优异的荧光猝灭性能，实现了灵敏的荧光生物检测［26，27］；利用磁性纳米核的独特磁学性能，实现了生物样品的分离和富集［28］、pH的磁共振成像（MRI）监测［29］、病原菌的原位靶向MRI检测［30］以及磁靶向的胃部口服药物递送［31］.

本文首先介绍了金属石墨纳米囊的制备方法，概述了不同类型金属石墨纳米囊的性质，然后介绍了它们在生物检测、细胞和活体层面的成像以及光介导的治疗等方面的最新应用研究进展，最后对金属石墨纳米囊的研究现状进行了分析总结并展望了其在生物医学领域的发展方向.

1 金属石墨纳米囊的制备与性质

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1.1 金属石墨纳米囊的制备

目前，金属石墨纳米囊的制备方法主要有射频热等离子体［32］、碳弧放电［33］、湿法化学合成［34］和化学气相沉积（CVD）［35~37］等. 碳弧放电法难以获得高质量的金属石墨纳米囊且难以控制其尺寸分布和形态. 湿法化学合成可以大规模制备金属石墨纳米囊［10］，但是反应条件苛刻，有时难以制备具有预期功能的石墨材料，且利用此方法制得的石墨层的质量不如CVD法. 相比较而言，CVD方法更易控制，可以用于大面积高质量石墨层的生长，是制备石墨纳米囊的典型方法. 因此本文仅讨论金属催化石墨烯生长的CVD方法用于金属石墨纳米囊的制备和应用.

利用CVD方法制备金属石墨纳米囊的机理与传统的块状金属催化石墨烯CVD合成方法相似［38，39］.采用金属基底作为催化剂以降低反应能垒，其表面上的碳原子通过直接扩散或溶解和偏析两种途径来实现不同厚度和质量石墨烯的生长，这两种途径在石墨烯CVD工艺中共存，具体哪种途径占主导地位取决于金属基底本身的性质［40，41］. 以通过气相SiO2为模板合成金属石墨纳米囊的CVD方法为例，限域在SiO2模板孔隙中的金属催化剂首先在高温下变成纳米液滴，然后由碳源（通常为甲烷）热解形成的碳原子在金属催化剂表面溶解，当碳原子达到饱和时会沉积在金属催化剂表面，快速冷却后石墨烯沉积在金属纳米颗粒表面获得SiO2模板限域的金属石墨纳米囊（Scheme 1），最后用HF刻蚀SiO2模板并通过离心洗涤获得干净的金属石墨纳米囊产物［10，11，17］. 为了提高金属石墨纳米囊的水溶性和生物相容性，已报道了共价［19］和非共价［18，42］两种方法用于实现金属石墨纳米囊的功能化，其中共价修饰的方法在一定程度上破坏了石墨壳的完整性，因而目前最常用的方式是通过疏水相互作用在其表面非共价修饰上两亲性聚乙二醇（PEG）分子［20~23］，以满足不同的生物医学应用需求.

Scheme 1 Mechanism and synthesis process of metal graphitic

Scheme 1 Mechanism and synthesis process of metal graphitic nanocapsules by CVD method

1.2 金属石墨纳米囊的性质

金属石墨纳米囊具有石墨纳米材料的一些固有特性，TEM测试表明金属石墨纳米囊为核壳型结构［35，36］，紫外-可见吸收光谱测试证明石墨烯外壳紫外特征吸收峰位于~265 nm处［18，22，28，30］，荧光光谱证明金属石墨纳米囊能够通过荧光共振能量转移（FRET）有效地猝灭荧光信号［26，27］. 由于具有化学惰性的外层石墨烯的保护，金属石墨纳米囊在水、酸、碱、盐溶液和氧化还原性环境中均展现出良好的稳定性［17，43］. 金属石墨纳米囊的石墨烯外壳有D（~1350 cm−1）和G（~1580 cm−1）2个固有的拉曼散射峰，而位于拉曼静默区（1800~2800 cm−1范围内的拉曼光谱区间）的2D峰（~2650 cm−1）强度由石墨烯的厚度决定，因此金属石墨纳米囊可以作为拉曼信号标签或者内标分子以提高拉曼分析的可靠性［18，20，44］. 受益于金属石墨纳米囊的石墨烯外壳具有大比表面积和离域π 电子结构的特点，通过疏水或者π-π 相互作用负载药物分子和靶向分子，可以进一步拓宽其生物医学应用的范畴［22~24］.

为了满足不同的生物医学应用，目前已经制备了不同组成、尺寸和形貌的金属石墨纳米囊. 根据内部金属核的组成和性质不同，金属石墨纳米囊主要分为等离子体石墨纳米囊（PGNs）、磁性石墨纳米囊（MGNs）和磁等离子体石墨纳米囊（MPGNs）［11］. PGNs的等离子金属核包括Au，Ag，Cu及其合金，其内部金属核的光学特性决定了PGNs的紫外-可见吸收光谱特性［17，37］. 受益于等离子体核和石墨壳的优异性能，PGNs已被广泛应用于拉曼检测与成像［18，20，21，44］、TPL成像［22，23］以及光介导的治疗［23~25］等. MGNs的金属核主要包括Co和FeCo合金. 利用MGNs优异的磁学性能可以实现生物样品的分离和富集以提高检测灵敏度［26，27］，还可实现生物体内的MRI［30］以及磁靶向药物递送应用［31］. MPGNs兼具有PGNs和MGNs的双重特性，目前已经成功制备了金纳米颗粒修饰的多层石墨磁性纳米囊（AGNs）［19］和磁性石墨烯隔离的金钴纳米晶（MACGs）［28］，实现了样品的分离、富集和灵敏的SERS生物分析以及成像.

2 金属石墨纳米囊的生物医学应用

新型金属石墨纳米囊材料兼具有石墨烯和金属纳米颗粒的双重性质，在生物医学应用领域具有潜在的应用价值. 利用石墨烯外壳优异的稳定性、良好的荧光猝灭性能、独特的拉曼散射特征峰、大的比表面积和离域的π 电子结构特点以及不同组成金属核各自独特的光学和磁学性能，可以实现广泛的功能应用［10~12，17］. 下文将详细介绍金属石墨纳米囊在生物检测、生物成像和治疗3个方面的应用.

2.1 金属石墨纳米囊的生物检测应用

SERS光谱技术继承了拉曼光谱的固有优势，并通过具有LSPR效应的贵金属纳米颗粒的激发来提高检测灵敏度，在生物分析方面具有广泛的应用价值［45~47］. SERS生物检测涉及到SERS基底与检测环境之间的相互作用，意味着SERS基底的合理设计至关重要［48~51］. 常用的SERS基底主要包括具有LSPR效应的Au，Ag，Cu及其合金［52，53］，然而检测环境（如长时间激光照射、强酸性或者高浓度盐溶液环境）引起的SERS基底聚集可能会导致信号波动大，待测物分子与SERS基底的直接接触可能会导致其碳化或者引发不必要的副反应，这很大程度上影响了SERS生物分析的重现性［11，17］.

由于少层石墨烯的保护，保证了PGNs和MPGNs内部等离子体纳米晶的稳定性，避免了待测物分子与SERS增强基底的直接接触，既不会引起待测物分子的光碳化也不会引发不必要的副反应. 基于石墨烯良好的荧光猝灭性能，能够通过FRET过程有效猝灭生物检测体系的背景荧光. 此外，它们还具有独特的拉曼散射特征峰，特别是位于拉曼静默区的2D峰可以作为内标，稳定性高且无需复杂的标记过程，在一定程度上避免了SERS定量不准确的问题，为可靠的SERS生物分析提供了保障［17］.

Bian等［23］率先通过简单的CVD方法制备了超稳定的石墨烯隔离的金纳米晶（GIANs），实现了对罗丹明6G的灵敏SERS分析，其增强倍数超过100，表明GIANs具有优异的SERS分析性能. 随后，Zhang等［18］利用GIANs位于拉曼静默区的2D峰作为无干扰内标校准了由实验因素（包括长时间激光照射、聚集深度差异和SERS基底的波动）以及检测环境（包括酸、碱、盐和蛋白质等）变化引起的信号波动造成的误差，提高了SERS分析的准确性，并基于此实现了鱼肉和鱼鳍中抗菌剂结晶紫（CV）的灵敏分析［图1（A）］. SERS技术能够提供丰富的指纹信息且灵敏度较高，然而在即时检测（Point-of-care，POC）应用中面临着样本中大量其它复杂分子的干扰，特别是非目标分子竞争性吸附在SERS基底上会引起分析结果不准确的问题［54，55］. 以与黄疸发病机制相关的自由胆红素检测为例，它通常会与血清中的蛋白结合，给基于SERS技术的胆红素的POC检测带来巨大挑战. 基于此，Zou等［20］利用GIANs的石墨烯外壳能够从白蛋白中萃取自由胆红素（BR）以及纤维素滤纸（CS）的分离富集性能，制备了GIANs负载的CS（CS@GIANs），实现了微量血液样品中自由BR的SERS检测，并利用石墨烯外壳的G峰作为内标，对检测结果进行校准，表明GIANs提供了一个抗干扰性强且灵敏度高的SERS分析平台，在临床POC应用领域具有潜在的应用价值［图1（B）］

Fig. 1 GIANs for sensitive SERS bioanalysis

前文介绍的工作均利用GIANs作为SERS基底实现了单相中的生物分析，然而实际样品中的待测物大多是分散在不同相中的混合物，如脂溶性和水溶性药物往往同时给药以用于协同治疗［56，57］. 实现对溶解性能不同的多种物质的拉曼光谱分析，通常需要分别使用合适的溶剂来溶解化学物质，在一定程度上对分析结果的准确性造成严重影响. Zhang等［58］利用GIANs在无需任何表面修饰的情况下能够在油水两相界面自组装的性质，提出了一种简单、灵敏、能够同时实现多相富集检测的SERS分析策略. 以9，10-双（苯基乙炔基）蒽（BPEA）和CV作为模型分子模拟血液中脂溶性和水溶性药物，利用界面自组装的GIANs膜实现了2种药物的同时多重SERS检测，并以2D峰作为内标对分析结果进行校准（图2）. 该工作构建的基于GIANs基底的SERS分析平台具有良好的多重能力，在临床药物监测中具有巨大的应用前景.

Fig. 2 GIANs for simultaneous multiphase SERS analysis

（A）Schematic diagram of multiphase Raman detectionwith GIANs；（B）SERS spectra for the multiplex interfacial detection of CV and BPEA；（C）schematic illustration of Raman analysis of CV and BPEA in mice；（D）blood analysis of mice injected with CV and BPEA（black line）. Insets of（B）are photographs of the solutions corresponding to the spectra. Adapted with permission from Ref.［58］. Copyright 2018，American Chemical Society.

与金纳米颗粒（AuNPs）相比，银纳米颗粒（AgNPs）具有更大的光学截面且价格更便宜［21，59］，但容易被氧化［60，61］，从而阻碍了其SERS分析应用. 利用与制备GIANs相类似的策略，通过CVD方法将AgNPs限域在少层惰性石墨壳内，能够有效保护其不受外界环境的干扰. Song等［21］制备了超稳定的石墨烯包覆的AgCu纳米晶（AgCu@G），具有优异的抗腐蚀性能，且能够极大地增强模型分子罗丹明6G的拉曼信号. 后来，Song等［44］再次利用性能优越的AgCu@G作为SERS基底，对其表面进行两亲性分子修饰，实现了罗非鱼肌肉样品中水溶性孔雀石绿和脂溶性隐色孔雀石绿的检测，并以D峰作为内标对检测结果进行了校准（图3）. 这种超稳定的AgCu@G具有抗干扰能力强、易功能化的特点且其拉曼散射特征峰可以作为稳定内标，展现出强大的SERS生物分析性能.

Fig. 3 AgCu@G for sensitive SERS bioanalysis

Schematic diagram(A), TEM image(B) and Raman spectrum(C) of AgCu@G, (D) SERS detection of LMG in contaminated fish muscle washed with different solvents. Adapted with permission from Ref. [44]. Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

Fig. 4 AgCu@G for sensitive SERS bioanalysis

（A）Schematic diagram of enrichment processes；（B）hot map of different CN− concentrations before and after enrichment；（C）change of logarithmic CN− concentration without（black）and with（blue）IS（inset is the linear fitting of the logarithmic CN−concentration）；（D）corresponding data analysis to demonstrate the cyanide clearance ability of MACGs in the water sample（height means intensity at 2124 cm−1，and ratio is I2124/I2675. P values were calculated by the Student’s t test：**** P<0. 0001）.Adapted with permission from Ref.［28］. Copyright 2019，American Chemical Society.

除了前文提到的PGNs以外，MPGNs在SERS生物分析领域也具有广泛的应用，特别是利用其磁性可以实现样品的分离和富集. Zou等［19］利用AGNs外层AuNPs之间的间隙产生大量等离子体“热点”，显著增强了待测物罗丹明B（RhB）的拉曼信号，同时利用其位于拉曼静默区的2D峰作为内标，减少了由衬底表面异质性和待测物分布不均匀导致的SERS定量误差，检出限低至40 fmol. Zhang等［28］通过CVD法制备了超稳定的MACGs，其外层化学惰性石墨烯壳保护了内部AuCo合金免受剧毒性CN−的腐蚀.石墨烯与CN−之间的作用力极其微弱，MACGs仍然能够直接捕获并清除CN−，并利用MACGs的磁分离富集能力明显提高了CN−的检测灵敏度，并通过其2D峰作为内标提高了SERS定量的准确性（图4）

Fig. 5 Co@G for fluorescence detection of DNA

（A）TEM image of Co@G；（B）suspensions of Co@G aqueous solution before（left）and after（right）magnetic enrichment；（C）schematic diagram of Co@G for fluorescence detection of DNA. Adapted with permission from Ref.［26］. Copyright

2017，Wiley-VCH.

MGNs在生物检测方面也有着广泛的应用前景. Song等［26］基于Co包裹的石墨纳米囊（Co@G）良好的磁分离富集能力和优异的荧光猝灭性能，构建了一种高效的DNA捕获和释放策略，实现了目标DNA分子的高灵敏荧光检测（图5）. Han等［27］利用Co@G优异的荧光猝灭性能和良好的磁分离富集能力实现了组蛋白乙酰转移酶活性的灵敏荧光检测，且发现其猝灭性能比氧化石墨烯、单壁碳纳米管和AuNPs更为优越. 这些工作证明了具有石墨烯和磁性纳米材料双重特性的Co@G有望成为分子疾病诊断的有力工具. 此外，Nie等［29］在FeCo包裹的石墨纳米囊（FeCo@G）上负载光活性分子10，12-二十五碳二炔酸（PCDA）单体，利用所得复合材料的荧光和T2弛豫性能，实现了pH的灵敏监测. FeCo@G优异的超顺磁性有效缩短了T2弛豫时间，能够作为酸性条件下pH响应的MRI造影剂

2.2 金属石墨纳米囊的生物成像应用

光学成像技术因其灵敏度高、特异性好和操作简便等优势，能够为生物分析提供更准确的多参数信息，在生物成像应用中受到了广泛的关注［62，63］. 其中，拉曼成像是一种具有高空间分辨率、光稳定性和多路复用能力的分子成像技术，已被广泛应用于表征细胞和亚细胞水平的生物过程，特别是在成像介导的治疗领域具有显著优势［64~66］. 金属石墨纳米囊作为一种新型的石墨烯纳米材料，比传统的有机拉曼标签具有更大的拉曼散射截面和更加优异的稳定性，已经被广泛应用于细胞内多模态拉曼成像，其中位于细胞静默区的2D峰作为成像标签可以有效避免环境的干扰［11，17］. 此外，PGNs或者MPGNs中的金属纳米核能够产生LSPR效应，赋予其优异的TPL性能，从而实现了生物体系的拉曼成像［21］以及拉曼和TPL双模成像［22，23］；基于MGNs优异的磁学性能和优异的稳定性，实现了pH的MRI监测［29］和胃部酸性极端环境的靶向MRI应用［30］. 下文将主要介绍不同类型的金属石墨纳米囊的多模态Raman和TPL成像以及MRI应用.

Fig. 6 Targeted cell imaging with GIANs

（A）Schematic illustration of Sgc-8 aptamer⁃ functionalized GIAN；（B）TPL confocal images of HeLa incubated with GIAN and GIAN-Sgc8. BF：bright field，scale bar：10 mm. Adapted with permission from Ref.［23］. Copyright 2014，Nature Publishing

Group.

Bian等［23］利用GIANs的D，G峰作为拉曼标签实现了人乳腺癌细胞MCF-7的拉曼成像，并利用其Au核和外层石墨烯的TPL性能实现了MCF-7细胞的TPL成像，拉曼和TPL相结合的双模态成像方式提高了成像的准确性. 在证实了GIANs的细胞内的共定位能力以后，进一步通过π-π 相互作用在其表面修饰上能够特异性识别蛋白质酪氨酸激酶7（PTK-7）的Sgc-8核酸适体，进而通过TPL成像区分PTK-7高表达的HeLa细胞和PTK-7低表达的95-C肺癌细胞，证明了GIANs具有优异的细胞靶向成像能力（图6）.基 于GIANs的细胞内共定位和靶向成像能力，Wang等［64］进一步通过Raman成像和TPL成像的方式研究了GIANs与Sgc-8适体功能化的GIANs进入HeLa细胞途径的差异，结果表明，GIANs通过小窝介导的内吞途径进入细胞，而经过Sgc-8适体功能化的GIANs通过网格蛋白介导的内吞作用被细胞吸收，证明基于GIANs的多模态成像研究可能促进具有受体靶向的纳米载体的开发，从而实现有效的药物输送和癌症治疗.

各向异性的金纳米棒（AuNRs）比AuNPs具有更大的光学吸收和散射截面. Lai等［22］通过限域的CVD方法制备了AuNR包裹的石墨纳米囊（AuNR@G）和AuNP包裹的石墨纳米囊（Au@G），并利用它们实现了MCF-7细胞的D，G模态拉曼成像和TPL成像. 结果表明，AuNR@G的拉曼和TPL 性能明显优于Au@G. 然后，在AuNR@G表面修饰上能够特异性靶向上皮细胞黏附分子的SYL3C核酸适体，通过拉曼和TPL成像实现了癌症组织与正常组织的区分，证明了AuNR@G具有优异的组织靶向成像能力（图7）. 此外，Zhang等［28］利用MACGs能够直接捕获CN−的性能，建立了铜绿假单胞菌感染的秀丽隐杆线虫（C. elegans）模型，通过D，G模态的拉曼成像证明MACGs能够进入C. elegans 体内，进而利用其优异的SERS性能实现了活体内铜绿假单胞菌生物标志物CN−的灵敏检测.

Fig. 7 Targeted tissue imaging with AuNR@G

（A）Structure of SYL3C aptamer；（B）schematic illustration of SYL3C aptamer⁃ functionalized AuNR@G；（C）targeted Raman imaging of cancerous breast and normal liver tissues of rat treated with aptamer-AuNR@G nanocapsules at room temperature for 40 min with 1. 0 s integration time per pixel（BF：bright-field；scale bar：10 μm）；（D）TPL confocal images of cancerous breast and normal liver tissues of rat treated with aptamer-AuNR@G nanocapsules（scale bar：50 μm）. Adapted with permission from Ref.［22］. Copyright 2016，American Chemical Society.

D，G峰信号与细胞内部分固有的信号重叠，以它们作为拉曼标签在一定程度上限制了其SERS成像的灵敏度和准确性. 利用位于细胞静默区的拉曼报告分子作为信号探针能够提高成像的准确性，是拉曼生物成像领域的研究热点之一［67~69］. Song等［21］通过非共价修饰的方法制备了炔基-PEG功能化的AgCu@G，利用D，G峰和炔基位于~2220 cm−1处的特征峰作为信号标签实现了MCF-7的多模态拉曼成像，其中位于静默区的炔基作为信号标签能够获得更可靠、更准确的拉曼成像. 然而，这种静默区拉曼信号探针不稳定且制备过程复杂，利用稳定的金属石墨纳米囊中位于细胞静默区的2D峰作为成像标签，在一定程度上解决了上述问题. 基于此，Zou等［43］通过改变CVD系统中同位素12C和13C的比例制备了5种具有不同2D峰位移的GIANs作为SERS成像标签. 首先，利用2D峰作为拉曼标签实现了A549细胞和C. elegans 的无背景拉曼成像，证明了GIANs在细胞和活体内的多通道SERS成像能力. 进一步将能够特异性识别膜蛋白的核酸适体修饰在SERS 编码的GIANs 标签表面作为内置编码，实现了HepG2和A549细胞系的快速成像和模式识别. 此类同位素GIAN-核酸适体编码器在无背景干扰的高度敏感癌细胞鉴定中具有巨大潜力，从而为将来的临床疾病诊断提供了强大而有价值的平台（图8）.

Fig. 8 Cancer cell pattern recognition with aptamer⁃function

A） Schematic illustration of pattern recognition and discrimination of cancer cell lines with multiplexed GIAN encoders；（B）SERS images of cancer cells（scale bar：10 mm. G100，G050 and G000 conjugated with DSPE-PEG-linked aptamer AS1411，S1. 6 and SYL3C，respectively）；（C）SERS barcodes of HepG2 and A549 cell lines；（D）statistics of normalized SERS signals shown in（B）. Adapted with permission from Ref.［43］. Copyright 2018，Royal Society of Chemistry.

Raman和TPL成像技术的穿透深度有限，难以实现活体成像诊断应用. 近些年发展起来的MRI技术具有无创性、时空分辨率高和穿透能力深而且能够追踪三维动态成像等优势，在分子成像和临床诊断中发挥了重要作用［70，71］.

Fig. 9 In situ targeted MRI detection of H. pylori with FeCo

（A）Schematic illustration of H. pylori detection with FeCo@G@B-PEG；（B）T2-weighted images at different times with or without FeCo@G@B-PEG treatments；（C）Raman images and spectra of mice gastric mucosa used in（B）（scale bar：10 mm；slice thick⁃ness：50 mm）. Adapted with permission from Ref.［30］. Copyright 2017，Nature Publishing Group.

MRI通常与Gd3+，Mn2+和超顺磁性氧化铁纳米颗粒等造影剂一起使用以增强信号［72~74］，然而这些常用造影剂在极端的酸性环境下不稳定，可能会造成大的毒副作用或者影响磁核与周围环境之间的质子弛豫，从而难以实现胃部疾病的诊断［30，31］. 具有优异磁学性能的MGNs具有优异的酸稳定性，在胃部的MRI应用领域具有潜在的应用价值. Li等［30］制备了超稳定的FeCo@G，并且通过疏水性相互作用在其表面修饰上可以结合细菌细胞壁中肽聚糖的苯硼酸-PEG分子，从而实现了小鼠胃部幽门螺旋杆菌（H.pylori）的原位靶向MRI成像检测. 最后，取出H. pylori 感染小鼠的胃部组织进行拉曼成像探究，能够明显地观察到D，G峰的拉曼信号，进一步验证了FeCo@G能够实现体内H. pylori 靶向成像检测的能力（图9）.

2.3 金属石墨纳米囊在治疗方面的应用

在纳米医学领域，光介导的化疗、光热治疗（PTT）和光动力学治疗等策略被广泛应用于疾病治疗和病原菌的杀灭，通常情况下会结合几种不同的治疗方法以增强治疗效果［75，76］. 近红外（NIR）激光辐射作为一种无创的外部刺激，照射皮肤和组织时只会产生微弱的吸收，因而能够有效降低治疗过程中的光毒性［77，78］. 具有LSPR效应的Au纳米晶可以通过光热过程将NIR光有效地转化为热量，因而被广泛应用于NIR光介导的PTT应用中［79］. 然而，Au纳米晶在长时间的激光照射下表现出较差的热稳定性，在一定程度上限制了它们的PTT应用［80，81］. 值得注意的是，GIAN和AuNR@G的外层石墨烯壳保护了内部Au核的稳定性，且石墨烯外壳也具有良好的NIR光吸收能力，使得它们成为更为理想的PTT试剂［23，24，28］. 此外，金属石墨纳米囊的石墨烯外壳还为负载药物分子或者靶向分子提供了优良的纳米平台，实现肿瘤药物的递送从而进一步拓宽其生物医学应用［23，24，31］. 下文将主要介绍金属石墨纳米囊作为光热试剂和药物载体在癌症PTT、化疗或者它们的联合治疗以及杀菌应用.

Bian等［23］利用GIANs良好的NIR光吸收性能实现了对癌细胞MCF-7的有效杀灭，证明GIANs能够作为良好的光热材料以杀死癌细胞. 为了进一步提高治疗效果，通过π-π 堆积相互作用将抗肿瘤药物阿霉素（DOX）固载于GIANs表面，制备了GIANs/DOX复合物，其具有良好的生物相容性，并实现了癌细胞的PTT与化疗的协同治疗. 在NIR激光的照射下，GIAN/DOX复合物孵育细胞的死亡率远高于DOX孵育细胞的死亡率，这表明GIANs的光热效应有效增强了DOX的化疗效果. 这种基于GIANs平台的PTT与化疗的系统治疗策略不仅提高了治疗效率，而且通过GIANs的光热效应实现DOX药物的可控释放减小了化疗药物带来的副作用，有望为临床癌症治疗指明新的方向（图10）.

Fig. 10 NIR photothermal enhanced chemotherapy of GIAN/DOX c

（A） NIR photothermal enhanced chemotherapy mechanism of GIAN/DOX；（B） UV-Vis characterization of the DOX-loaded GIANs；（C）cell viability of MCF-7 cells with and without NIR laser irradiation after incubation with free DOX，GIAN，and GIAN/DOX，respectively. Adapted with permission from Ref.［23］. Copyright 2014，Nature Publishing Group.

PTT在癌症治疗领域的应用颇为广泛且在一定程度上避免了化疗带来的副作用，有望成为传统癌症治疗手段的替代方法或者补充. 然而，在PTT过程中过高的温度会损害细胞膜的完整性并释放出细胞内成分，进而引发炎症反应［82］. 非甾体抗炎药物阿司匹林的代谢产物水杨酸酯可以抑制各种促炎细胞因子的产生［83，84］，然而它缺乏特定的药物靶点和个体差异性，阻碍了其作为自由药物制剂的使用.

基于此，Dong等［24］合成了P-阿司匹林前药，通过疏水和π-π 堆积相互作用将其吸附在AuNR@G表面，制备了AuNR@G-P-阿司匹林复合物，以消除PTT过程中引发的炎症反应. 结果表明，P-阿司匹林前药在肿瘤微环境中可从复合物中有效释放出来，使得促炎细胞因子水平恢复正常；通过尾静脉注射复合物后，在NIR激光的照射下实体瘤被有效消融，同时白介素-6和肿瘤坏死因子-α 也被抑制. 另外，经P-阿司匹林前药锚定的AuNR@G对肿瘤周围细胞和主要器官没有明显损伤，表明其具有良好的生物相容性. 此工作充分利用了AuNR@G优异的PTT效果，实现了实体瘤的高效光热消融，同时作为药物递送平台实现了抗炎症前药的有效递送并消除了PTT过程引发的炎症反应（图11）.

Fig. 11 Pyrene⁃aspirin⁃loaded AuNR@G for simultaneous photot

（A）Synthesis of P-aspirin；（B）illustration of surface functionalization and P-aspirin releasing from AuNR@G；（C）illustration of the anti-inflammatory mechanism underlying the inhibition of PTT-associated inflammation by AuNR@G-P-aspirin complexes. Adapted with permission from Ref.［24］. Copyright 2018，Wiley-VCH.

AuNR@G具有可调节的表面等离子体激元和NIR光吸收性能，不仅可以用于癌细胞和实体瘤的PTT应用，也可以实现NIR激光诱导的抗菌治疗. 传统的基于抗生素的细菌治疗方法会产生明显的副作用，比如全身性细胞毒性、容易产生耐药性以及导致耐药菌的出现［85，86］，而NIR激光诱导PTT在很大程度上可以解决上述问题［87，88］. Xu等［25］利用光热试剂AuNR@G的优势，结合毒性低、柔韧性好、吸水性强以及环境刺激响应性迅速的水凝胶，设计了一种AuNR@G掺杂的聚乙烯醇/壳聚糖水凝胶体系，对革兰氏阴性大肠杆菌和阳性金色葡萄球菌均具有高效的光热抗菌效果. 该方法构建的AuNR@G掺杂的水凝胶体系避免了抗生素的毒副作用，在细菌的PTT领域具有广阔的应用前景（图12）.

Fig. 12 AuNR@G doped poly(vinyl alcohol)/chitosan(AG⁃PC) hyd

AuNR@G doped poly(vinyl alcohol)/chitosan(AG⁃PC) hydrogel for photothermal antibacterial applications （A）Preparation of the AG-PC hydrogel；（B）NIR laser-induced antibacterial experiments using the AG-PC hydrogel.

金属石墨纳米囊也被广泛用作药物递送平台，具有独特磁学性能的MGNs药物递送平台对胃部疾病的治疗具有新的功能应用. 胃部复杂的强酸性和富含蛋白酶环境、胃黏液屏障的阻碍和口服药物滞留时间短等因素影响了胃部口服药物的有效递送［89，90］. 基于磁性纳米材料优异的磁学性能，目前在磁靶向的药物递送等方面取得了一定的进展，特别是磁性纳米材料的形貌可控组装可能有助于药物分子的定点递送［91，92］. 然而，在恶劣的胃部环境下载药平台不稳定且难以实现原位的可控组装，从而使得药物递送效率极大的受限. Cai等［31］开发了一种胃蛋白酶桥联和磁场介导的MGN针状组装体，能够在酸性环境下可控地实现可逆自组装，且相比于MGN具有更好的细胞膜穿透能力和磁性响应运动能力. 基于此，利用胃部环境固有的胃蛋白酶作为“桥梁”，在磁场的介导下实现了针状组装体的原位组装，通过MRI和拉曼成像验证了针状组装体克服了胃黏液屏障且增强了黏膜穿透深度. 进一步在MGN表面负载上抗癌药物DOX，结果表明，DOX负载的针状组装体具有优异的磁靶向胃癌细胞杀伤能力，且在小鼠胃部具有极好的DOX渗透能力. 这种磁场介导的原位自组装平台增强了跨黏液屏障运输效率，为口服药物的递送和胃部疾病的位点选择性治疗提供了新的思路（图13）.

Fig. 13 In situ pepsin⁃assisted needle assembly of MGNs for

In situ pepsin⁃assisted needle assembly of MGNs for enhanced gastric retention and mucus penetration （A）Illustration of gastric retention and penetration in vivo；（B）T2-weighted MRI of BALB/c mice（left）and isolated mouse stomach（right）after administration with MGNs at different time with and without application of MF. Adapted with

3 总结与展望

本综述系统总结了CVD方法制备金属石墨纳米囊的机理、分类、性质及其在生物检测、生物成像和治疗3个方面的最新研究进展. 根据内部金属核的性质进行分类，金属石墨纳米囊可以分为PNGs，MGNs和MPGNs等. 少层化学惰性石墨壳赋予了金属石墨纳米囊优异的稳定性，且不影响内部金属核的功能发挥，在生物医学领域具有广泛的应用前景.

金属石墨纳米囊的石墨烯外壳具有如下特点：（1）固有的D，G和2D 3个拉曼散射特征峰可以作为稳定的拉曼标签或者内标，特别是位于拉曼静默区的2D峰可以有效解决SERS定量不准确的问题；（2）避免了待测物分子或者外界环境与内部金属核直接接触，既不会引起待测物分子的光碳化也不会引发不必要的副反应；（3）能够通过FRET过程有效猝灭生物体系的背景荧光信号或者荧光探针的信号；（4）易于修饰且具有大的比表面积，能够通过疏水或者π-π 相互作用负载靶向分子或者药物分子. 基于石墨烯外壳的众多优势，结合PNGs内部金属核优异的SERS和TPL性能，实现了生物分子的灵敏SERS分析、癌细胞或组织的靶向拉曼和TPL成像、癌细胞和病原菌的PTT应用以及实体瘤的PTT与化疗协同治疗；结合MGNs内部金属核的磁分离富集、磁靶向和T2弛豫性能，实现了生物分子的高效捕获和灵敏的荧光检测、pH的MRI监测、H. Pylori 的靶向MRI检测以及增强的胃部口服药物滞留和黏液穿透；结合MPGNs内部金属核的SERS性能和磁分离富集性能，实现了对生物分子的SERS定量分析、CN−的直接捕获检测、高效富集和清除以及活体内铜绿假单胞菌生物标志物的SERS成像检测.

在金属石墨纳米囊应用于临床诊疗之前，了解它们在生物体系中的毒理学特征和代谢行为至关重要. 一定浓度范围的PEG功能化的金属石墨纳米囊对细胞活性没有明显的抑制作用，展现出良好的生物相容性；通过尾静脉注射适量浓度的AuNR@G至小鼠体内，对细胞形态和主要器官无明显伤害［24］；通过口服适量浓度的MGN至小鼠体内，对细胞形态和胃黏膜没有明显损伤，且在12 h以内绝大部分的颗粒已经排出体外［30］. 然而，通过尾静脉注射或者口服的金属石墨纳米囊是否会对生物体内造成长期毒性这一问题还未探究. 此外，目前报道的金属石墨纳米囊的种类有限，主要应用于体外生物分子检测、细胞成像以及癌细胞和病原菌的杀灭，活体层面的原位疾病诊断、药物递送和治疗等领域的应用较少. 我们后续的工作将主要集中在开发多种新型的金属石墨纳米囊材料，通过合理的方式进行功能化以提高它们的生物相容性，并深入探究它们对生物体造成的长/短期影响，以推动金属石墨纳米囊的生物医学应用向前发展.

作者：朱兆田1，李圣凯1，宋明慧1，蔡芯琪1，宋志灵2，陈龙3，陈卓1

1. 湖南大学化学化工学院, 化学生物传感与计量学国家重点实验室,分子科学与生物医学实验室；

2. 青岛科技大学化学与分子工程学院, 山东省生化分析重点实验室,光电传感与生命分析教育部重点实验室；

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780−1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

相机部分：

红外二区成像系统针对小动物成像

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

暗室及控制系统：

1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

⭐️ ⭐️ ⭐️ 应用案例⭐️⭐️ ⭐️

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm−2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

⭐️ ⭐️ ⭐️ 案例结束⭐️⭐️ ⭐️

沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统， 性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

红外二区成像系统针对小动物成像